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　　在白酒的酿造过程中，跟着时间推移，环境因子的改变与生物因素驱动着酒醅微生物进行组装与演替，微生物群落的组装是指微生物群落从无到有或从简单到复杂的形成过程，描述了不同微生物种群如何通过一系列生态过程（如选择、扩散、漂变和物种形成）在特定环境中聚集并形成稳定的群落结构。而群落的演替是指在一定环境条件下，微生物群落的组成、结构和功能随时间推移而发生的有序、可预测的变化过程。微生物在组装与演替的过程中代谢各种各样的风味物质并积累。

　　Bacillus）是浓香型白酒酿造过程中重要的功能菌属，与酵母菌、乳杆菌以及霉菌等白酒酿造过程中的关键微生物联系紧密，同时能代谢产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多种酶，芽孢杆菌的增加或减少会影响酒醅微生物的群落结构。微生物间的相互作用也会影响群落的组装过程，而利用互联网分析可以量化微生物相互作用，进一步分析微生物相互作用对群落组装的影响。

　　四川轻化工大学食品与酿酒工程学院的曹卫林、黄丹*和四川郎酒股份有限公司的沈毅*等从浓香型酒厂取得摊晾拌曲后的酒醅以及窖池当中的黄水，其中黄水能够给大家提供浓香型白酒发酵过程中的窖泥微生物，用摊晾拌曲后的酒醅和黄水构建了浓香型白酒酒醅的多菌发酵实验体系，同时加入从浓香型白酒酒醅分离得到的枯草芽孢杆菌（

　　Bacillus subtilisJP1）进行生物扰动实验。通过扩增子测序技术和生物信息统计学探究发酵过程酒醅微生物群落组成变化，以及枯草芽孢杆菌对酒醅微生物环境生态位宽度和相互作用的影响，以期解析枯草芽孢杆菌对酒醅微生物群落的组装过程及演替速度的影响机制。

　　通过多样性指数和主坐标分析（PCoA）了解枯草芽孢杆菌对酒醅微 生物群落

　　多样性和多样性的影响。发酵过程中微生物多样性的变化见图1A、B，微生物丰富度用Shannon指数表示，EG和BG细菌多样性指数有着相似的变化趋势，均先下降后上升，在第8天时达到最低，随后上升至23 d后趋于平稳，枯草芽孢杆菌的 添加明显降低了EG的细菌多样性，这表明枯草芽孢杆菌可能对细菌的生长具有着强烈的抑制作用；EG和BG真菌多样性指数变化趋势也相似，线天后开始趋于平稳，EG中真菌多样性指数在整个发酵过程中总体都低于BG，说明芽孢杆菌能产生抗菌物质，可能会引起了微生物多样性的降低。基于Bray-Curtis距离对EG和BG在发酵期间的微生物进行PCoA，由图1C、D可知，BG与EG的置信椭圆显示酒醅微生物在发酵过程中有显著的阶段性特征（P1：0～16 d，P2：23～40 d），酒醅发酵过程中的微生物群落结构往往具有阶段性特征，且这种阶段差异是由于微生物群落对外部条件的适应而产生。与BG相比，真菌在EG中的阶段性特征更弱，枯草芽孢杆菌改变了真菌群落的演替。另外，EG和BG发酵过程中的细菌群落和真菌群落分布均有明显的分离，ANOSIM分析表明两组间差异显著（P＜0.01）（细菌（相对强度R＝0.503 8）、线）），说明枯草芽孢杆菌对微生物群落结构造成了影响。这些改变这可能是酒醅微生物群落中微生物相互作用的调节，或者由于芽孢杆菌分泌各种次级代谢产物，从而对群落的结构和演替造成了影响。

　　浓香型白酒的发酵是微生物群落动态变化同时发酵的过程，对发酵过程微生物组成动态变化的了解有助于探究枯草芽孢杆菌对菌群组装及演替的影响。采用高通量扩增子测序技术，从酒培中获得了1 482 203 条细菌和1 794 103 条真菌的高质量序列，稀疏曲线表明，从酒醅获得的序列饱和，因此确保了测序数据的充分性，其中参与发酵过程的细菌有27 门、62 纲、151 目、274 科、550 属，线A所示，BG和EG中微生物组成变化相似，发酵过程中的优势细菌属有芽孢杆菌属（

　　）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、醋杆菌属（Acetobacter）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、栖热菌属（Thermus）、不动杆菌属（Acinetobacter）等。Lactobacillus在发酵初期占比较大，随着发酵的进行慢慢地减少，与之前研究相似，而PaenibacillusAcetobacter的占比随着发酵持续不断的增加。与BG相比，EG中初始细菌组成由于添加了枯草芽孢杆菌，使得Bacillus在第0天相对丰度增加，但在发酵结束时两组的Bacillus相对丰度接近，微生物群落有一定抵抗外来物种入侵能力，同时Bacillus是浓香型白酒发酵过程中优势物种之一，与其他酒醅微生物在长期驯化过程中有着独特关系网，实验增加了初始Bacillus的相对含量，但随着发酵的进行又回到了其在群落中的生态位上，执行其功能。基于线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）效应量（LDA effect size，LEfSe）分析（LDA≥2，P＜0.05）获得组间具有非常明显差异的细菌信息（图2C），差异细菌有红球菌属（Rhodococcus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）、普雷沃氏菌属（Prevotella）等。

　　如图2B所示，BG和EG中的优势真菌属有未分类的曲霉属（unclassified_f__Aspergillaceae）、曲霉属（

　　）、红曲霉属（Monascus）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）等，其中unclassified_f__Aspergillaceae在发酵初期占比很大，随着发酵的进行慢慢地减少，IssatchenkiaKazachstania随着发酵进行丰度增加。Aspergillus在BG中是主要菌属，在整个发酵过程相对丰度在30%左右，而在EG中相对丰度显著下降（7%左右），这原因是枯草芽孢杆菌对Aspergillus产生拮抗作用；Monascus在EG后期占比增加，LEfSe分析结果（图2D）显示Monascus是EG与BG两组的显著差异微生物，MonascusBacillus有着代谢合作，常用于其他发酵产品制备。其余差异真菌属有Aspergillus、有孢汉逊酵母属（Saccharomycodes）、毕赤酵母属（PichiaKazachstania等，后三者相对丰度在EG中更高。Pichia是产乙醇的重要贡献者，其相对丰度提高，这可能会给环境因子带来改变，影响微生物群落的组装过程。2 枯草芽孢杆菌对酒醅微生物群落构建的影响

　　基于零模型（999 个随机化）计算了β最接近的分类单元指数（βNTI），用以评估芽孢杆菌对酒醅微生物发酵过程随机性过程和确定性过程对群落组装机制的影响[33]。如图3A、C所示，在发酵过程中细菌和真菌均受随机性过程（βNTI＜2）以及确定性过程（βNTI＞2）影响，且主要是由随机性过程主导。在βNTI基础上，利用Raup-Crick指数（RCbary值）将确定性过程和随机过程划分为5 个生态过程并确定每个生态过程的相对重要性[34]。由图3B、D可知，枯草芽孢杆菌影响了酒醅发酵过程中微生物群落的组装过程。细菌群落中，同质选择对群落组装的贡献从19.44%增到了20.33%，异质选择从0.00%增加到2.77%，扩散限制从13.88%降至4.16%，同质扩散从9.72%降至8.33%，生态漂移从56.94%增至63.88%。真菌群落中，同质选择对群落的贡献从5.55%增加至22.22%，异质选择从9.72%降至6.94%，扩散限制从8.33%增加至41.66%，生态漂移从76.38%降至29.16%。

　　这些根据结果得出，随机过程在酒醅发酵过程中主导了微生物群落的组装，但枯草芽孢杆菌的加入改变了异质选择、同质选择、扩散限制、同质扩散和生态漂移对群落组装的贡献，导致了发酵过程微生物群落的分化。细菌的异质选择过程从0.00%增加至2.77%，真菌的同质选择过程贡献从5.55%增加至22.22%，使酒醅微生物群落的组装过程更具确定性。确定性过程保留了适应能力强的微生物，从而增强了某些群落特有的功能，随机性过程可以丰富物种的功能多样性，有助于维持生态系统的稳定性，因此确定性过程的增加可能导致了群落在组装过程中物种多样性的降低。确定性过程是由生物因素及非生物因素共同决定，确定性过程的增加，说明枯草芽孢杆菌的加入可能导致环境因子及微生物相互作用发生了改变。

　　酒醅发酵过程中理化因子的变化与微生物群落演替及代谢情况紧密关联，酒醅的水分含量、乙醇含量、还原糖和总酸含量变动情况如图4所示。其中水分含量和乙醇含量作为感官上最直观的理化参数之一，对微生物组生长代谢具有非常明显的驱动作用。BG与EG的水分含量和乙醇含量呈现了相似的变化趋势，均表现为第0～16天快速上升，第16～40天开始下降并趋于平缓，其中发酵第16天时酒醅乙醇含量达到最大值，BG和EG组分别为（8.35±0.07）、（9.73±0.07）mL/100 g。还原糖作为微生物群落的基本营养的东西，在酒醅发酵中扮演着至关重要的作用。在发酵第0～8天，BG与EG的还原糖质量分数持续增加并达到最大，最大值分别为（8.90±0.13）%、（9.06±0.15）%，这可能是起始酒醅微生物快速分解淀粉导致还原糖含量上升，芽孢杆菌属是α-葡萄糖苷酶（3.2.1.20）基因的优势微生物，EG中高丰度的芽孢杆菌导致了其拥有更高的还原糖含量。BG与EG的总酸含量在发酵第0～16天时，上升速率最快，分别为（0.45±0.03）、（0.44±0.01）mmol/10 g。在发酵第16～40天时，EG的总酸含量明显高于BG。各理化指标在0～23 d内均有较大变化，在23 d后变化幅度减小。受枯草芽孢杆菌的影响，EG与BG的理化指标有着相似的变化趋势，但变化幅度有所不同。

　　环境的改变会导致生态位重构，这驱动了细菌或真菌群落的聚集，前面的分析指明，加入枯草芽孢杆菌后，酒醅发酵过程中的理化指标变化发生了显著差异，为了探究这种改变对酒醅微生物的影响，通过计算物种在两个发酵体系中的环境生态位宽度，能了解该物种对环境资源的利用程度和适应能力的改变。根据Jiao Shuo等的方法计算了每个物种分别在EG和BG中的环境生态位宽度，对环境生态位宽度增加或减少的物种数量进行了统计，同时为了表征群落内部的微生物变动情况，根据微生物的相对丰度将其划分为6 个亚群落：稀有类群、丰富类群、中间类群、条件稀有类群、条件丰富类群、条件稀有或丰富类群。如图5A、B所示，细菌菌群中，与BG相比，EG中大部分物种的环境生态位宽度都降低，同时降低了整个细菌群落的生态位宽度，而真菌群落中环境生态位宽度下降与上升的物种数量相当，真菌群落整体的生态位宽度变化也不大，说明枯草芽孢杆菌对细菌菌属的生态位宽度影响大于真菌，这种差异表明真菌群落中微生物占据更广的生态位宽度，对环境变化具有更高的适应能力及抵抗能力，在环境改变后依然能更广泛的利用资源。EG中细菌、真菌的稀有类群的数量都明显地增加，同时条件稀有类群和条件稀有或丰富类群的物种数量明显降低，说明EG当中微生物的生存压力更大，导致一些物种相对丰度在整个发酵过程中下降甚至是消失。枯草芽孢杆菌的添加影响了酒醅微生物的环境生态位宽度，这可能解释了酒醅微生物多样性的变化。

　　为了明确环境生态位宽度的改变对酒醅微生物亚群落组成的影响，计数EG和BG各亚群落的共有成员。如图5C、D所示，细菌群落中EG和BG的稀有类群和条件稀有类群共有成员最多；其次在EG当中的稀有类群和BG当中的条件稀有类群有36 个共有成员，相比于BG，EG有21 个成员的环境生态位宽度会降低。真菌群落中EG的稀有类群和BG的条件稀有类群共有成员最多，总共97 个，有68 个的环境生态位宽度下降。条件稀有类群相对于稀有类群，在微生物群落中拥有更高的相对丰度，EG中稀有类群与BG中条件稀有类群的高相似度，说明大多数微生物在EG当中相对丰度下降，同时环境生态位宽度的降低，证明了微生物对环境的利用程度和范围降低，枯草芽孢杆菌通过影响浓香型白酒发酵过程中微生物的环境生态位宽度进而导致稀有类群物种数的增加。而稀有类群对环境更敏感，稀有菌群与优势菌群的占比会影响群落对环境干扰的抵抗与恢复能力，因而可能会对酒醅发酵过程中微生物群落的演替速度与方向造成影响。

　　枯草芽孢杆菌的加入影响了酒醅中微生物的生态位重构，微生物亚群落结构改变，同时各亚群落的环境生态位宽度改变，如图6A～C所示，展示了酒醅微生物主要的3 个亚群落的环境生态位宽度变化，细菌中稀有类群的环境生态位宽度显著下降，条件稀有类群和条件稀有或丰富类群的环境生态位宽度无显著变化；真菌中稀有类群和条件稀有类群的环境生态位宽度显著上升，而条件稀有或丰富类群的环境生态位宽度显著下降。稀有类群对环境的响应与变化，对微生物群落总体差异贡献大于丰富类群，这影响了微生物群落的演替速率（图6D、E）。酒醅发酵过程中细菌稀有类群数量及占比增加，优势物种（相对丰度＞1%）数减少，且稀有类群的环境生态位宽度降低，更容易受环境影响而改变，加快了酒醅发酵过程细菌群落的演替速度。而真菌稀有物种数量增加，但相对于BG，EG中稀有类群和条件稀有类群的环境生态位宽度增加，减弱了亚群落受环境的影响，降低了真菌群落演替速度。

　　环境的改变推动了微生物群落的演替，同时微生物间相互作用也会推动群落的演替，为了研究芽孢杆菌对酒醅发酵过程中微生物相互作用的影响，基于Spearman相关性系数构建了微生物共现网络（

　　＜0.05）。由图7A、B可知，BG的微生物共现网络共分为5 个模块、211 个节点、512 条边，网络平均加权度6.029，模块化系数0.879。EG的网络共分为5 个模块、262 个节点、1 851 条边，网络平均加权度23.816，模块化系数0.551。EG网络中的稀有类群和条件稀有类群占比增加，而丰富类群以及条件稀有或丰富类群的占比下降。EG中微生物共现网络平均加权度与边数明显地增加，且模块化系数降低。如图7C、D所示，相比BG，EG网络中各模块的条件稀有类群的占比增加，且稀有类群和条件稀有类群在各模块中分别变得均匀。稀有类群与条件稀有类群对环境变化更加敏感，两者在各模块中分布的增加可能推动微生物群落结构的改变。

　　这些结果说明枯草芽孢杆菌增加了稀有类群的数量与种类，增强了稀有类群在微生物网络结构中的功能，同时微生物网络的模块化程度降低，微生物之间关系更复杂，微生物网络的稳定性降低，特别的，实验组共现网络中最大的模块1全是细菌，而第3大的模块3也仅有3 个真菌属，两模块分别占了网络的18.70%和16.79%，芽孢杆菌的增加使得细菌群落内部联系更紧密，使细菌群落更不稳定，推动了细菌群落的组装与演替。